作为经常上头条的明星，光遗传学（optogenetics）和CRISPR这两个技术的碰撞会产生什么样的火花？2015年，科学家结合CRISPR和光遗传学技术，开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。

从时空上控制转录

最初的光激活CRISPR系统于2015年年初发表，侧重于利用光来控制转录。两个独立的实验室，东京大学的Moritoshi Sato实验室和杜克大学的Charles Gersbach实验室，基于光诱导的异源二聚体隐花色素2（CRY2）和整合素结合蛋白1（CIB1），开发出相似的系统。他们的目标是利用光来开启和关闭基因的表达，同时赋予时空控制和可逆性。

Nihongaki等人开发出的系统是由两个融合蛋白组成的：1) 基因组锚定物 – 失活的Cas9蛋白（dCas9）与CIB1融合；2) 激活物 – CRY2光裂合酶同源区域（CRY2PHR）与转录激活域（VP64或p65）融合。一旦在细胞中表达，在gRNA指引下，dCas9-CIB1与目标DNA序列结合，而CRY2PHR-激活物自由漂浮。在蓝光的照射下，CRY2和CIB1二聚化，带来激活物，激活基因转录。

研究人员测试了多种组合来优化融合蛋白。他们发现，表现最好的组合是NLS-dCas9-trCIB1和NLSx3-CRYPHR-p65。在蓝光（470nm）的照射下采用狭缝模式，研究人员发现，人ASC1基因的表达可被空间控制。他们还不断开启和关闭蓝光，发现ASC1的表达也跟着做，说明控制的确是可逆且可重复的。

Polstein等人开发的光激活CRISPR/Cas9效应物（LACE）系统也采用了相似的策略，不过采用了不同的融合蛋白组合。经过优化的LACE系统包括：1) CIBN-dCas9-CIBN，其中CIBN是CIB1的N端片段，与dCas9的N端和C端融合；2) CRY2FL-VP64，全长的CRY2与转录激活域VP64融合。在HEK293T细胞中利用此系统来诱导人IL1RN的表达，研究人员发现2小时后mRNA水平提高11倍，30小时后提高400倍。此系统也被证明是可逆的和可重复的。

光活化的基因组修饰

之后，Sato实验室又推出了光活化系统来切割目标DNA序列，它产生的双链断裂（DSB）可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）来修复。这个系统的独特之处在于它利用了一种“分裂的”核酸酶。作者将Cas9分成N端（2-713个残基，N713）和C端（714-1368个残基，C714）。作者将每个Cas9片段与一个二聚化的结构域相融合，创建了光活化的Cas9工具。

尽管作者尝试了几种不同的光活化设计，但他们最成功的设计是利用了磁性光控蛋白，来源于真菌感光体Vivid。这个新系统的昵称为paCas9-1，包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714，显示出低背景和高的诱导活性。与全长的Cas9相比，paCas9-1识别相同的PAM，并有着相似的定位特异性。在蓝光的激发下，paCas9-1能通过NHEJ诱导插入缺失（频率为20.5%），并通过HDR诱导修饰（频率为7.2%）。

作者还表明，他们能够通过修改paCas9-1来降低系统的背景活性。他们用nMagC714来取代nMagHigh1-C714，生成了paCas9-2。这种改变并未明显改变系统生成突变的效率，但降低了背景DSB。与他们之前的工作一样，Sato实验室还表明paCas9-2可以在空间上控制，并通过蓝光开关来可逆激活。

正如人们所期望的，Nihongaki等人证明，替换融合物中的Cas9结构域，也可以生成光活化的切口酶和抑制物（dCas9）。所有变异体的活性都是可逆且可重复的。

罩住CRISPR

此外，Alexander Deiters的实验室则采用了一种不同的方法来调控CRISPR。他们利用遗传编码的光罩（photocaging）技术，在Cas9蛋白上插入了一个可光去除的保护基团，也就是硝基苯罩住的赖氨酸（PCK）。为了在Cas9的特定位点插入PCK，研究小组使用了吡咯赖氨酰tRNA合成酶，在到达琥珀终止密码子时加入PCK。

研究人员首先检验了罩住Cas9的哪个赖氨酸能够让蛋白的切割能力更好地失活，发现是K866赖氨酸。然后，他们利用双报告基因荧光检测，证明Cas9 K866PCK突变体的确失活，而用紫外光（365nm）照射后，它显示出与野生型Cas9同样的切割活性。最后，研究人员证明，这种光罩Cas9系统能够让内源的基因表达沉默。

如今，无论你想激活、抑制或修改基因，你身边都有工具，通过光来控制基因组编辑。随着CRISPR和光遗传学的发展，我们期待未来看到更多更酷的应用。（生物通 薄荷）